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  • 益智康脑丸对老年性痴呆大鼠行为学及脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

    日期:2012-12-28 10:42

    伍小燕1*,李 茂2

    (1.广西中医学院第一附属医院,南宁市 530023;2.广西中医药研究院,南宁市 530022)中图分类号 R285;R97 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010)39-3673-03

    (2. 

    摘 要

    目的:探讨益智康脑丸对老年性痴呆(AD)大鼠行为学及脑组织凋亡蛋白的影响。

    方法:复制D-半乳糖AD大鼠模型。实验分为4组,即空白、模型、益智康脑丸和脑复康组,检测大鼠行为学及脑组织抑制细胞凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表达指标的改变。

    结果:模型组与空白组比较,学习记忆能力显著下降,Bcl-2/Bax比值下降;治疗组与模型组比较,学习记忆能力显著改善,Bcl-2/Bax比值增加。

    结论:益智康脑丸具有较好的治疗AD作用,其机制可能与促进AD大鼠脑组织Bcl-2的表达、降低Bax 的表达有关。

    关键词 老年性痴呆;益智康脑丸;行为学;B细胞淋巴瘤/白血病-2;B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白

    Effect of Yizhi Kangnao Pills on Ethology and the Expression of Bcl-2 and Bax in Cerebral Tissue of ADRatsWU Xiao-yan(The First Affiliated Hospital of Guangxi College of TCM,Nanning 530023,China)LI Mao(Guangxi Institute of TCM,Nanning 530022,China)

     

     

    老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD),是指老年老化程度超过生理性老化,或过早老化,致使脑功能障碍,引起获得性、持续性智能障碍,是以进行性痴呆为主要

    表现的神经退行性疾病。其首要症状是智力、记忆力、感官定向能力、判断力、语言思维能力不可逆的进行性退化,并常伴有性格改变。益智康脑丸用于治疗脾肾两亏、脑髓空虚所致

    之老年性痴呆病,临床应用多年,疗效显著。本研究旨在通过复制老年性痴呆大鼠模型,探讨该方对模型大鼠行为学及神经细胞凋亡的影响,以进一步阐明其作用机制。

    1 仪器与材料

    1.1 仪器

    脑立体定位仪(淮北正华公司);被动回避反应箱(上海骐驰仪器有限公司);CX31型显微镜(日本Olympus公司)。

    1.2 试药

    益智康脑丸(广西强寿药业集团有限公司,批号:060901,每丸重3 g,由0.9%生理盐水配制为所需浓度);脑复康(天津金世制药有限公司,批号:060318);促进细胞凋亡基因Bax、抑制细胞凋亡基因Bcl-2免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

    1.3 动物

    健康Wistar大鼠40只,6~7周龄,♀♂兼用,体质量180~220 g,由广西医科大学实验动物中心提供(生产许可证号:SCXK 桂 2003-0003)。

    2 方法

    2.1 模型的复制

    参考文献

    [1],采取D-半乳糖+喹啉酸(QA)法复制老年性痴呆大鼠模型。除空白组每日ip 0.5 mL生理盐水外,其余各组每日ip 0.5 mL D-半乳糖(500 mg·kg-1),连续7周,复制大鼠衰老模型。7周后除空白组外,各组大鼠均用1%的戊巴比妥钠麻醉,固定在脑立体定位仪上,暴露前囟,按脑立体定位图谱钻开颅骨,缓慢将微量注射器垂直进入到注射部位,注射lµL 75 nmol·µL-1的QA。注射完毕后,留针10 min,然后缓慢拔针,用牙科泥封堵颅骨上的钻空。术后1周各组进行行为学测试。

    2.2 分组及给药

    将40只大鼠随机分为空白(等量生理盐水)、模型(等量生理盐水)、脑复康(0.7 g·kg-1)和益智康脑丸(4.5 g·kg-1)组。ig给药,每天1次,连续给药3周。术后进行1周行为学测试后给药,连续ig 3周后再进行行为学测试。

    2.3 行为学测试

    采用跳台法。跳台装置为一个25 cm×20 cm×75 cm的被动回避反应箱,箱底铺直径为1 mm的铜栅,通36 V 交流电,铜栅的一角固定一个8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫块作为动物回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中自由活动5 min熟悉环境,然后接通铜栅电源,大鼠受到电击后跳回安全区以躲避伤害性刺激,然后大鼠再次跳至铜栅上,受到电击(双足同时接触铜栅)又跳回安全区,如此反复5 min,记录每只大鼠首次找到安全区至第一次跳下安全区的时间(潜伏期)和5 min内受到的电击次数(错误次数),作为测试结果。第1天为学习训练期,其后连续7 d测试,记录各组大鼠5 min内触电潜伏时间及错误次数,计算其平均值。

    2.4 脑组织Bcl-2、Bax含量的测定

    [2]在行为学测试结束后,进行脑组织取材。大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定头及四肢,开胸暴露心脏,经左心室插管至主动脉,同时剪开右心耳,依次用Ringer液、4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液200 mL灌注固定大鼠,注毕取脑,固定于苦味酸中12~24 h,石蜡包埋,切片,常规脱蜡至水,进行免疫组化染色。用蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min后进行微波抗原修复,用3% H2O2去离子水孵育5~10 min,以消除内源性过氧化物酶活性。滴加正常血清封闭液,室温孵育 10~15min,倾去,勿洗。每张切片加入 1∶200倍稀释Bax、Bcl-2抗体,37 ℃孵育2 h,PBS冲洗后加入生物素化二抗工作液,37 ℃孵育10~15 min,PBS冲洗后加入辣根酶标记链霉卵白素,室温孵育10~15 min,PBS冲洗,DAB显色,苏木精复染,脱水,二甲苯透明后中性树脂封片,显微镜观察。镜下观察,细胞核

    与细胞浆内出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞,每组取8个切片,每个切片随机取5个视野,计数阳性细胞,取平均值进行比较。

    2.5 统计学方法

    所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。计量资料数据以x±s表示,组间比较采用方差分析;计数资料率的比较采用卡方检验。P<0.05表示差异有显著性。

    3 结果

    3.1 行为学测试结果

    用药前,与空白组比较,各组大鼠跳台潜伏期均缩短,错误次数显著增加(P<0.05);用药后,与模型组比较,益智康脑丸组与脑复康组大鼠跳台潜伏期均显著延长,触电错误次数

    显著减少(P<0.05),但两药物组之间比较无显著差异(P>0.05)。结果表明,益智康脑丸可以改善模型大鼠学习记忆能力。各组大鼠跳台潜伏期比较见表1;各组大鼠跳台错误次数

    比较见表2。

    表1 各组大鼠跳台潜伏期比较(x±s)

    Tab 1 Comparison of latency in the step down tes(tx±s)

     

    组别

     

    剂量/g·kg-1

     

    数量

    用药前潜伏期/s

     

    用药后潜伏期/s

     

    空白组

     

    -

    10

    241.25±40.36

     

    250.15±51.20

     

    模型组

     

    -

    10

    176.02±36.25

     

    173.08±32.17

     

    益智康脑丸组

     

    4.5

    10

    180.14±40.81

     

    216.68±43.37

    #

     

    脑复康组

     

    0.7

    10

    178.30±45.04

     

    220.14±30.75

    #

     

     

    与空白组比较:*P<0.05;与模型组比较:#P<0.05

    vs. blank group:*P<0.05;vs. model roup:#P<0.05

    表2 各组大鼠跳台错误次数比较(x±s)

    Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down test(x±s)

    组别

     

    剂量/g·kg-1

     

    数量

    治疗前错误次数

     

    治疗后错误次数

     

    空白组

     

    -

    10

    4.5±1.8

     

    4.3±1.4

     

    模型组

     

    -

    10

    10.1±2.6

     

    9.9±1.8

     

    益智康脑丸组

     

    4.5

    10

     

    7.9±1.6

     

    5.1±2.9

    #

     

    脑复康组

     

    0.7

    10

    8.2±2.1

     

    5.5±3.4

    #

     

     

    与空白组比较:*P<0.05;与模型组比较:#P<0.05

    vs. blank group:*P<0.05;vs. model group:#P<0.05

     

    3.2 脑组织Bcl-2和Bax免疫组化结果与空白组比较,模型组 Bax、Bcl-2 蛋白表达显著增强(P<0.01);与模型组比较,益智康脑丸组与脑复康组Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著增强(P<0.01),两药物组之间比较无显著差异(P>0.05)。结果表明,益智康脑丸能显著抑制Bax 蛋白表达,促进Bcl-2 蛋白表达,从而抑制细胞凋亡。各组大鼠脑组织Bcl-2和Bax表达的比较见表3。

    表3 各组大鼠脑组织Bcl-2和Bax表达的比较(x±s)

    Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax incerebral tissue of rats(x±s)

    组别

     

    剂量/g·kg-1

     

    数量

    Bax

     

    Bcl-2

     

    Bcl-2/Bax

     

    空白组

     

    -

    10

    2.04±0.18

     

    1.92±0.68

     

    0.94

     

    模型组

     

    -

    10

    15.29±2.65

     

    7.91±1.36

     

    0.52

     

    益智康脑丸组

     

    4.5

    10

    8.26±2.04

    #

     

    16.31±3.19

    #

     

    1.97

     

    脑复康组

     

    0.7

    10

    8.51±3.06

    #

     

    14.62±2.94

    #

     

    1.72

     

    与空白组比较:*P<0.01;与模型组比较:#P<0.01

    vs. blank group:*P<0.01;vs. model group:#P<0.01

    4 讨论

    近年来研究表明,细胞凋亡参与了中枢神经系统的退行性病变,与衰老和老年性痴呆的发生存在着密切联系。老年性痴呆神经元凋亡的具体机制可能与凋亡相关蛋白表达失调等因素有关。细胞内与凋亡有关的基因分为2类:诱导凋亡基因和抑制凋亡基因。在神经细胞凋亡中,Bcl-2家族是不可缺少的,Bcl-2是重要的抗凋亡基因,在细胞色素C的释放调控中起重要作用[2]。Bcl-2与Bax是一对相互拮抗的蛋白质,它们形成二聚体,拮抗对方的功能,Bcl-2具有明显抑制凋亡作用,而Bax则促进凋亡。Bax和Bcl-2形成复合体而失去作用。由此可见,损伤刺激后,Bax和Bcl-2表达的比率在很大程度上影响凋亡的产生[3]。

     

        益智康脑丸是立足于壮医理论而成方,以壮族民间药物五指毛桃根、扶芳藤为主药,配合牛大力、千斤拔、红参、熟地、肉苁蓉、山药等诸药合用,共奏补脾肾、益精血、健脑髓、养“巧坞”之功,临床用于治疗脑髓空虚、“巧坞”失养之老年性痴呆、脑萎缩症疗效显著

    [4]。本研究结果表明,造模后,在机体的一种自我保护机制下,Bcl-2蛋白表达反应性增强,同时启动了凋亡程序,使Bax表达增强,促进细胞凋亡的发生。药物干预后,Bcl-2表达增强,Bax表达减弱,抑制细胞凋亡。表明益智康脑丸对老年性痴呆的改善作用可能是通过上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白的表达,抑制细胞凋亡而实现,从而改善老年性痴呆大鼠的学习记忆能力。

     

    参考文献

    [ 1 ] 齐曦明,韩玉生,周忠光,等.痴呆灵胶囊对老年痴呆大鼠学习记忆影响及其机制的实验研究[J].中医药学报,2004,32(1):45.

    [ 2 ] Wnag HQ,Nakaya Y,Du ZY,et al. Interaction of prese-nilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mito-chondiral Bcl-2[J].Hum Mol Genet,2005,14(13):1 889.

    [ 3 ] Yao MZ,Nguyen TV,Pike C,et al. B-Amyloid-indu-ced neuronal apoptosis involves c-jun N-terminal ki-nase-dependent downergulation of Bcl-w[J]. Journal Ne-urosci,2005,25(5):1 149.

    [ 4 ] 黄汉儒.中国壮医学[M].南宁:广西民族出版社,2000:12.

     

     

    China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 39 中国药房 2010 年第 21 卷第 39 期

    (收稿日期:2010-06-11 修回日期:2010-08-23)

    *硕士研究生。研究方向:药理学。电话:029-82655140。E-mail:liyue.0105@spu.xjtu.edu.cn

    # 通讯作者:教授,博士。研究方向:新药药理评价。电话:029-82655140。

    本文地址:http://www.qsyy.net/qs/yzknwlx/323.html