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    日期:2012-12-27 14:39

    扶芳藤提取物对小鼠免疫功能的影响研究

    肖艳芬,黄 燕,王 琳,王 坤,肖 健

    (广西中医学院微生物学与免疫学教研室,广西 南宁 530001)

    【摘 要】

    目的 探讨扶芳藤提取物对小鼠免疫功能的影响。

    方法 通过检测免疫抑制小鼠的脏器/体质量比值、巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞转化率以及血清溶血素的变化,观察不同剂量水平的扶芳藤乙醇提取物对小鼠免疫功能的影响。

    结果 中、高剂量的扶芳藤提取物可明显提高免疫抑制小鼠的脏器/体质量比值、巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞转化率以及血清溶血素含量(P<0.05)。

    结论 扶芳藤提取物可以增强小鼠免疫功能。

    【关键词】 卫矛科; 植物提取物; 扶芳藤; 免疫系统/药物作用; 小鼠

    文章编号: 1009-5519(2012)12-1768-02 中图法分类号: R967 文献标识码:

    扶芳藤[Euonymus fortunei(Turcz.)Hand.-Mazz.]属卫矛科卫矛属植物,又名换骨筋、小藤仲,《本草拾遗》称扶芳藤能“主一切血,一切气,一切冷,去百病。久服延年,变白,不老……”[1]。

    前期研究表明复方扶芳藤合剂具有抗疲劳、增强免疫功能的作用[2-3],但是扶芳藤作为复方扶芳藤合剂方中的君药,目前对其药理学与免疫学作用机制知之甚少。本研究通过建立环磷酰胺(cyclophos-phamide,Cy)所致免疫抑制小鼠模型 ,利用扶芳藤提取物 (extractof euonymus fortunei)进行干预,探讨扶芳藤对小鼠免疫功能的作用机制,为临床应用扶芳藤提供进一步的实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 药物的制备

    取扶芳藤 1 kg,加入相当于药材 10 倍量的水,在不锈钢锅内煮开后1 h,过滤,保留滤液 ;药渣再加 8 倍于生药量的水,煮开后文火煎30 min,过滤去渣 ,合并两次滤液 ,浓缩至相当于原生药量的容量即1 000 mL 时 ,取出冷却 ;然后加入 95%食用乙醇,边加边搅拌,直至药液中含乙醇为80%时,放置 48 h,在24 h 内搅拌 3~4 次后,静置 24 h,过滤去渣 ,滤液在旋转回收器中回收乙醇至无醇时,将无醇的液体加热,浓缩成每毫升2.0 g生药的药物,保留于4 ℃冰箱,使用时再用双蒸水稀释成所需浓度[4]。此外,本实验所用Cy 购自江苏恒瑞医药股份有限公司 ,批准文号:国药准字H32026196;ConA 为美国 Sigma 公司产品 ,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2)配制至100 μg/mL,置-20 ℃冰 箱保存备用;红细胞裂解液购自上海博蕴生物科技有限公司;2%、10%绵羊红细胞(SRBC)、10%鸡红细胞以及新鲜豚鼠血清由本教研室自备。

    1.2 方法

    取健康昆明种小鼠 50 只,雌雄各半,6 周龄,体质量18~22 g,由广西医科大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK 桂2008-0003。将所有小鼠随机分为 5 组:(1)实验组(扶芳藤提取物加Cy);(2)对照组(Cy);(3)空白组(生理盐水)。其中实验组包括高、中、低3 个剂量组(高剂量组 200 mg/kg、中剂量组 100 mg/kg,低剂量组50 mg/kg)。各组小鼠分笼饲养 ,自由进食 ,喂标准颗粒 饲料,饮纯净水。本研究采用Cy制造免疫抑制小鼠模型 :Cy按 40mg/kg 给实验组与对照组小鼠腹腔注射 ,每天 1 次 ,共 3 d。实验组同时给予扶芳藤提取物灌胃,按相应剂量给药,每天1 次 ,共15 d;对照组给予生理盐水腹腔注射。另外再取昆明种小鼠 50 只,按上述方法分组并用药,用于血清溶血素测定试验。

    1.2.1 脏器/体质量比值测定

    脱颈椎处死小鼠,称量体质量,再分离胸腺、脾脏,称质量后分别计算脏器指数。以脏器质量(mg)/体质量(10 g)作为脾脏和胸腺指数。

    1.2.2 腹腔巨噬细胞吞噬功能测定

    实验结束前 1 d,腹腔注射淀粉溶液2 mL 作为诱导剂 ;实验结束前 1 h,腹腔注射 10%鸡红细胞0.2 mL,处死小鼠后用 PBS 液 2 mL 洗出腹腔巨噬细胞 ,将洗出液置于载玻片上,30 min后洗涤,固定,行姬姆萨染色,油镜下每张片计100 个巨噬细胞 ,并计吞噬鸡红细胞的细胞数 ,吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100 个巨噬细胞×100%。

    1.2.3 淋巴细胞转化试验

    取小鼠脾脏置于 2 mL RPMI1640 培养液中研磨,过200 目细胞筛,1 000 r/min 离心 10 min 后,弃上清液,用红细胞裂解液2 mL 重悬后反应 7 min,1 000 r/min离心10 min,用RPMI1640 培养液重悬细胞,配置成 5×106mL-1细胞悬液。取96 孔细胞培养板,按每 100 μL 培养基 5×105个细胞的量铺板;加入ConA,使终浓度为 5 μg/mL;将培养板置 CO2培养箱反应24 h后取细胞涂片,行瑞氏染色,油镜下每张片计 100 个淋巴细胞,并计中度转化及以上的细胞数,淋巴细胞转化率=发生中度转化及以上的细胞

    /100 个淋巴细胞×100%。

    1.2.4 血清溶血素的测定

    末次给药前 7 d 给每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2% 绵羊红细胞(SRBC)进行免疫,末次给药前 2 d 再次:给予0.2 mL 2% SRBC 进行再次免疫,2 d 后断颈取血,分离血清并稀释500倍 。另取试管 ,依次加入经稀释的血清 0.5 mL、10%SRBC 0.5 mL、新鲜豚鼠血清 0.5 mL,并加入 45 ℃琼脂液使琼脂糖终浓度为1.4%,倒入小平皿并封闭,置 37 ℃水浴孵育 1 h 后计算空斑形成数量。

    1.3 统计学方法

    各组实验数据以x±s表示,组间差异使用 SPSS14.0 软件进行分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 扶芳藤提取物对小鼠脏器/体质量比值的影响

    结果表明 ,空白组小鼠的脾脏指数与胸腺指数均显著高于对照组(P<0.01),提示小鼠免疫抑制模型的建立是成功的。在此基础上,本研究发现,与对照组比较,低剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数升高,但是两组间差异不明显;中、高剂量组可提高免疫抑制小鼠的脾脏指数(中剂量组 P<0.05,高剂量组 P<0.01)和胸腺指数(P<0.01)。与空白组比较,低剂量组小鼠的脾脏指数与胸腺指数降低(P<0.01),中、高剂量组小鼠的脾脏指数和胸腺指数降低但组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表 1。注:与对照组比较,aP<0.05;bP<0.01;与空白组比较,cP<0.01。

    2.2 扶芳藤提取物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

    与对照组比较,中、高剂量组和空白组小鼠巨噬细胞吞噬率显著升高(P<0.01),但低剂量组差异无统计学意义 (P>0.05);与空白组比较 ,低、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬率显著降低(低剂量组P<0.01,中、高剂量组P<0.05);中 、高剂量组比较差异无统计学意义 (P>0.05),见表 2。

    2.3 扶芳藤提取物对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响

    与对照组比较,低、中、高剂量组和空白组小鼠脾淋巴细胞转化率显著升高(低剂量组 P<0.05,中 、高剂量组和空白组 P<0.01);与空白组比较,低剂量组淋巴细胞转化率明显降低(P<0.01),中、高剂量组差异无统计学意义(P>0.05);中、高剂量组间淋巴细胞转化率比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表 3。

    2.4 扶芳藤提取物对小鼠血清溶血素生成的影响

    与对照组比较,中、高剂量组与空白组小鼠溶血空斑形成数显著升高(P<0.01);低剂量组溶血空斑形成数升高,但差异无统计学意义 (P>0.05)。与空白组比较,低剂量组溶血空斑形成数明显降低(P<0.05);中、高剂量组溶血空斑形成数升高,但差异无统计学意义(P>0.05),见表4。注:与对照组比较,aP<0.01;与空白组比较,bP<0.05。

    3 讨 论

    随着复方扶芳藤合剂的广泛应用,作为该方剂的君药,扶芳藤的作用机制也随之受到研究者们的重视。扶芳已被证明含有较大比例的卫茅醇和扶芳藤多酚[5-6]。动物实验表明,扶芳藤可以减少缺血再灌注兔心肌细胞Bax 蛋白的表达,升高 Bcl-2,从而抑制再灌注心肌细胞凋亡[7]。

    本课题组的前期研究也发现,扶芳藤提取物可以减少大鼠缺血再灌注脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 的产生,这可能是因为扶芳藤提取物参与了缺血再灌注损伤过程的免疫调节功能[2,8]。提示扶芳藤可能通过相应免疫应答机制发挥免疫调节功能。免疫系统是保护机体免受外来感染及维持免疫稳定与监视功能的执行者,由免疫器官、免疫细胞、免疫分子3 部分构成。免疫器官的体积与质量在经受免疫抑制药物(如Cy)作用后会因大量免疫细胞的死亡而减少。

    本研究发现扶芳藤提取物可以维持脾脏指数与胸腺指数处于正常小鼠水平,表明扶芳藤提取物对维持免疫器官的质量发挥着重要的作用。机体针对外来抗原的第一道防线是天然免,其中巨噬细胞与树突状细胞、中性粒细胞同属天然免疫的免疫细胞,它主要通过吞噬、消化外来病原发挥抗感染功能。

    本研究发现,扶芳藤提取物可以提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的功能,提示扶芳藤提取物可能通过促进吞噬细胞的吞噬能力而行使免疫保护功能。脾脏是成熟的淋巴细胞定居与执行免疫保护功能的场所,T淋巴细胞在脾脏通过识别抗原,分化增殖为效应性T 细胞继而发挥细胞免疫功能。淋巴细胞转化试验可以检测 T 淋巴细胞分化增殖的程度。

    本研究发现扶芳藤提取物能提高免疫抑制小鼠的淋巴细胞转化率,表明扶芳藤提取物参与了执行细胞免疫功能。除细胞免疫外,体液免疫是机体特异性免疫的另一组成部分,抗体是执行体液免疫的主要分子。抗体在针对外来红细胞的杀伤过程中又被命名为溶血素,它是衡量体液免疫功能最重要的指标。

    本研究发现扶芳藤提取物能促进溶血素的生成 ,提示它可能具有提高体液免疫应答的功能。

    表4 各组小鼠淋巴细胞溶血空斑比较(x±s)

    3 各组小鼠淋巴细胞转化率比较(x±s)

    2 各组小鼠巨噬细胞吞噬率比较(x±s)

    1 各组小鼠免疫器官指数比较(x±s)

    扶芳藤提取物具有增强小鼠天然免疫、细胞免疫以及体液免疫功能的作用,这为临床应用扶芳藤提供了理论依据。但是,由于扶芳藤提取物属乙醇提取物,其成分比较复杂,因此,鉴别分析扶芳藤提取物的主要有效成分问题,将需要进一步的实验去研究解决。

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