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益智康脑丸对老年性痴呆(AD)大鼠行为学及脑组织凋亡蛋白的影响

   2013-06-24 09:26:21    作者:

益智康脑丸对老年性痴呆(AD)大鼠行为学及脑组织凋亡蛋白的影响
 
伍小燕1*,李 茂2
(1.广西中医学院第一附属医院,南宁市 530023;2.广西中医药研究院,南宁市 530022)中图分类号 R285;R97 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010)39-367

益智康脑丸对老年性痴呆(AD)大鼠行为学及脑组织凋亡蛋白的影响

 

伍小燕1*,李 茂2

1.广西中医学院第一附属医院,南宁市 5300232.广西中医药研究院,南宁市 530022)中图分类号 R285R97 文献标识码 A 文章编号 1001-0408201039-3673-03 广西强寿药业:www.qsyy.net

2. 

摘 要

目的:探讨益智康脑丸对老年性痴呆(AD)大鼠行为学及脑组织凋亡蛋白的影响。

方法:复制D-半乳糖AD大鼠模型。实验分为4组,即空白、模型、益智康脑丸和脑复康组,检测大鼠行为学及脑组织抑制细胞凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表达指标的改变。

结果:模型组与空白组比较,学习记忆能力显著下降,Bcl-2/Bax比值下降;治疗组与模型组比较,学习记忆能力显著改善,Bcl-2/Bax比值增加。

结论:益智康脑丸具有较好的治疗AD作用,其机制可能与促进AD大鼠脑组织Bcl-2的表达、降低Bax 的表达有关。

关键词 老年性痴呆;益智康脑丸;行为学;B细胞淋巴瘤/白血病-2B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白

Effect of Yizhi Kangnao Pills on Ethology and the Expression of Bcl-2 and Bax in Cerebral Tissue of ADRatsWU Xiao-yanThe First Affiliated Hospital of Guangxi College of TCMNanning 530023ChinaLI MaoGuangxi Institute of TCMNanning 530022China

 

 

老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer diseaseAD),是指老年老化程度超过生理性老化,或过早老化,致使脑功能障碍,引起获得性、持续性智能障碍,是以进行性痴呆为主要

表现的神经退行性疾病。其首要症状是智力、记忆力、感官定向能力、判断力、语言思维能力不可逆的进行性退化,并常伴有性格改变。益智康脑丸用于治疗脾肾两亏、脑髓空虚所致

之老年性痴呆病,临床应用多年,疗效显著。本研究旨在通过复制老年性痴呆大鼠模型,探讨该方对模型大鼠行为学及神经细胞凋亡的影响,以进一步阐明其作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

脑立体定位仪(淮北正华公司);被动回避反应箱(上海骐驰仪器有限公司);CX31型显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 试药

益智康脑丸(广西强寿药业集团有限公司,批号:060901,每丸重3 g,由0.9%生理盐水配制为所需浓度);脑复康(天津金世制药有限公司,批号:060318);促进细胞凋亡基因Bax、抑制细胞凋亡基因Bcl-2免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 动物

健康Wistar大鼠40只,67周龄,♀♂兼用,体质量180220 g,由广西医科大学实验动物中心提供(生产许可证号:SCXK 2003-0003)。

2 方法

2.1 模型的复制

参考文献

[1],采取D-半乳糖+喹啉酸(QA)法复制老年性痴呆大鼠模型。除空白组每日ip 0.5 mL生理盐水外,其余各组每日ip 0.5 mL D-半乳糖(500 mg·kg-1),连续7周,复制大鼠衰老模型。7周后除空白组外,各组大鼠均用1%的戊巴比妥钠麻醉,固定在脑立体定位仪上,暴露前囟,按脑立体定位图 谱钻开颅骨,缓慢将微量注射器垂直进入到注射部位,注射lµL 75 nmol·µL-1QA。注射完毕后,留针10 min,然后缓慢拔针,用牙科泥封堵颅骨上的钻空。术后1周各组进行行为学测试。

2.2 分组及给药

40只大鼠随机分为空白(等量生理盐水)、模型(等量生理盐水)、脑复康(0.7 g·kg-1)和益智康脑丸(4.5 g·kg-1)组。ig给药,每天1次,连续给药3周。术后进行1周行为学测试后给药,连续ig 3周后再进行行为学测试。

2.3 行为学测试

采用跳台法。跳台装置为一个25 cm×20 cm×75 cm的被动回避反应箱,箱底铺直径为1 mm的铜栅,通36 V 交流电,铜栅的一角固定一个8 cm×8 cm×5 cm大小的塑料泡沫块作为动物回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中自由活动5 min熟悉环境,然后接通铜栅电源,大鼠受到电击后跳回安全区以躲避伤害性刺激,然后大鼠再次跳至铜栅上,受到电击(双足同时接触铜栅)又跳回安全区,如 此反复5 min,记录每只大鼠首次找到安全区至第一次跳下安全区的时间(潜伏期)和5 min内受到的电击次数(错误次数),作为测试结果。第1天为学习训练期,其后连续7 d测试,记录各组大鼠5 min内触电潜伏时间及错误次数,计算其平均值。

2.4 脑组织Bcl-2Bax含量的测定

[2]在行为学测试结束后,进行脑组织取材。大鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定头及四肢,开胸暴露心脏,经左心室插管至主动脉,同时剪开右心 耳,依次用Ringer液、4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液200 mL灌注固定大鼠,注毕取脑,固定于苦味酸中1224 h,石蜡包埋,切片,常规脱蜡至水,进行免疫组化染色。用蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min后进行微波抗原修复,用3 H2O2去离子水孵育510 min,以消除内源性过氧化物酶活性。滴加正常血清封闭液,室温孵育 1015min,倾去,勿洗。每张切片加入 1∶200倍稀释BaxBcl-2抗体,37 ℃孵育2 hPBS冲洗后加入生物素化二抗工作液,37 ℃孵育1015 minPBS冲洗后加入辣根酶标记链霉卵白素,室温孵育1015 minPBS冲洗,DAB显色,苏木精复染,脱水,二甲苯透明后中性树脂封片,显微镜观察。镜下观察,细胞核

与细胞浆内出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞,每组取8个切片,每个切片随机取5个视野,计数阳性细胞,取平均值进行比较。

2.5 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。计量资料数据以x±s表示,组间比较采用方差分析;计数资料率的比较采用卡方检验。P0.05表示差异有显著性。

3 结果

3.1 行为学测试结果

用药前,与空白组比较,各组大鼠跳台潜伏期均缩短,错误次数显著增加(P0.05);用药后,与模型组比较,益智康脑丸组与脑复康组大鼠跳台潜伏期均显著延长,触电错误次数

显著减少(P0.05),但两药物组之间比较无显著差异(P0.05)。结果表明,益智康脑丸可以改善模型大鼠学习记忆能力。各组大鼠跳台潜伏期比较见表1;各组大鼠跳台错误次数

比较见表2

1 各组大鼠跳台潜伏期比较(x±s

Tab 1 Comparison of latency in the step down testx±s

 

组别

 

剂量/g·kg-1

 

数量

用药前潜伏期/s

 

用药后潜伏期/s

 

空白组

 

-

10

241.25±40.36

 

250.15±51.20

 

模型组

 

-

10

176.02±36.25

 

173.08±32.17

 

益智康脑丸组

 

4.5

10

180.14±40.81

 

216.68±43.37

#

 

脑复康组

 

0.7

10

178.30±45.04

 

220.14±30.75

#

 

 

与空白组比较:*P0.05;与模型组比较:#P0.05

vs. blank group:*P0.05vs. model roup#P0.05

2 各组大鼠跳台错误次数比较(x±s

Tab 2 Comparison of incorrect times in the step down testx±s

组别

 

剂量/g·kg-1

 

数量

治疗前错误次数

 

治疗后错误次数

 

空白组

 

-

10

4.5±1.8

 

4.3±1.4

 

模型组

 

-

10

10.1±2.6

 

9.9±1.8

 

益智康脑丸组

 

4.5

10

 

7.9±1.6

 

5.1±2.9

#

 

脑复康组

 

0.7

10

8.2±2.1

 

5.5±3.4

#

 

 

与空白组比较:*P0.05;与模型组比较:#P0.05

vs. blank group:*P0.05vs. model group#P0.05

 

3.2 脑组织Bcl-2Bax免疫组化结果与空白组比较,模型组 BaxBcl-2 蛋白表达显著增强(P0.01);与模型组比较,益智康脑丸组与脑复康组Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著增强(P0.01),两药物 组之间比较无显著差异(P0.05)。结果表明,益智康脑丸能显著抑制Bax 蛋白表达,促进Bcl-2 蛋白表达,从而抑制细胞凋亡。各组大鼠脑组织Bcl-2Bax表达的比较见表3

3 各组大鼠脑组织Bcl-2Bax表达的比较(x±s

Tab 3 Comparison of the expression of Bcl-2 and Bax incerebral tissue of ratsx±s

组别

 

剂量/g·kg-1

 

数量

Bax

 

Bcl-2

 

Bcl-2/Bax

 

空白组

 

-

10

2.04±0.18

 

1.92±0.68

 

0.94

 

模型组

 

-

10

15.29±2.65

 

7.91±1.36

 

0.52

 

益智康脑丸组

 

4.5

10

8.26±2.04

#

 

16.31±3.19

#

 

1.97

 

脑复康组

 

0.7

10

8.51±3.06

#

 

14.62±2.94

#

 

1.72

 

与空白组比较:*P0.01;与模型组比较:#P0.01

vs. blank group:*P0.01vs. model group#P0.01

4 讨论

近年来研究表明,细胞凋亡参与了中枢神经系统的退行性病变,与衰老和老年性痴呆的发生存在着密切联系。老年性痴呆神经元凋亡的具体机制可能与凋 亡相关蛋白表达失调等因素有关。细胞内与凋亡有关的基因分为2类:诱导凋亡基因和抑制凋亡基因。在神经细胞凋亡中,Bcl-2家族是不可缺少的,Bcl- 2是重要的抗凋亡基因,在细胞色素C的释放调控中起重要作用[2]Bcl-2Bax是一对相互拮抗的蛋白质,它们形成二聚体,拮抗对方的功 能,Bcl-2具有明显抑制凋亡作用,而Bax则促进凋亡。BaxBcl-2形成复合体而失去作用。由此可见,损伤刺激后,BaxBcl-2表达的比 率在很大程度上影响凋亡的产生[3]

 

    益智康脑丸是立足于壮医理论而成方,以壮族民间药物五指毛桃根、扶芳藤为主药,配合牛大力、千斤拔、红参、熟地、肉苁蓉、山药等诸药合用,共奏补脾肾、益精血、健脑髓、养巧坞之功,临床用于治疗脑髓空虚、巧坞失养之老年性痴呆、脑萎缩症疗效显著

[4]。本研究结果表明,造模后,在机体的一种自我保护机制下,Bcl-2蛋白表达反应性增强,同时启动了凋亡程序,使Bax表达增强,促进细 胞凋亡的发生。药物干预后,Bcl-2表达增强,Bax表达减弱,抑制细胞凋亡。表明益智康脑丸对老年性痴呆的改善作用可能是通过上调Bcl-2蛋白、下 调Bax蛋白的表达,抑制细胞凋亡而实现,从而改善老年性痴呆大鼠的学习记忆能力。

 

参考文献

[ 1 ] 齐曦明,韩玉生,周忠光,等.痴呆灵胶囊对老年痴呆大鼠学习记忆影响及其机制的实验研究[J].中医药学报,2004321):45.

[ 2 ] Wnag HQNakaya YDu ZYet al. Interaction of prese-nilins with FKBP38 promotes apoptosis by reducing mito-chondiral Bcl-2[J].Hum Mol Genet20051413):1 889.

[ 3 ] Yao MZNguyen TVPike Cet al. B-Amyloid-indu-ced neuronal apoptosis involves c-jun N-terminal ki-nase-dependent downergulation of Bcl-w[J]. Journal Ne-urosci2005255):1 149.

[ 4 ] 黄汉儒.中国壮医学[M].南宁:广西民族出版社,200012.

 

 

China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 39 中国药房 2010 年第 21 卷第 39

(收稿日期:2010-06-11 修回日期:2010-08-23

    硕士研究生。研究方向:药理学。

    通讯作者:教授,博士。研究方向:新药药理评价。