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  • 三七总皂苷对老年性痴呆大鼠空间探索学习记忆力的影响

    日期:2012-12-27 09:41

    钟振国 屈泽强 鲍运平 王乃平 张凤芬 张要艳

              (广西中医学院 广西530001)

    摘要:目的探讨三七总皂(PNS)对老年性痴呆(AD)模型大鼠空间学习记忆功能障碍的改善作用。方法以D一半乳糖腹腔注射致亚急性损伤合并鹅膏草氨酸损毁双侧大脑Meynert基底核建立AD大鼠动物模型;Mom。水迷宫进行学习记忆能力检测。结果PNS高、低剂量组大鼠在Morris水迷宫测试中,逃避潜伏期明显缩短,寻求次数、原平台象限比、跨越原平台次数明显增加,与模型组比较有显著意义(P<0.05)a结论PNSAD模型大鼠空间学习记忆损害具有明显改善作用。

    关键词:三七总皂;老年性痴呆;动物模型;Morris水迷宫。水迷宫;学习与记忆;大鼠

    中圈分类号:8285. 5

    老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer' sdisease , AD ),是一种大脑神经退行性疾病,65岁以上人群发病率约3%}5%,随着世界人口逐年老化,其发病率也在不断上升,但目前仍缺乏有效的防治药物和方法。三七为五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng ( Burk )  F. H.Chen的根,传统中医理论认为其性味甘、微苦、温,归肝胃经,具有化痕、止血、活血定痛之效,现代药理研究表明,三七对心血管系统、血液系统、免疫系统、神经系统等均有不同的药理作用,而对神经系统损害的保护作用尤引人注目。三七的药理活性成分的研究主要集中在三七皂贰成分和氨基酸。为此,我们应用Morris水迷宫( Morris water maze,  MWM)评价T三七总皂( total saponins of Panax notoginseng, PNS)对由D一半乳糖(D-galactose , D-gal)致亚急性衰老加上鹅膏荤氨酸(ibotenic acidIBA)损毁脑Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert, nbM)所致的AD大鼠模型的学习记忆能力的保护作用。

     

    1实验材料

    1. 1药品和试剂

    PNS:由云南玉溪维和制药厂提供;石杉碱甲( huperzin A , HupA):上海复旦复华药业有限公司生产(批号:030202 ) ; D-gal:上海恒信化学试剂有限公司生产(批号:20020406 ) ; IBA ; Sigma ChemicalCo. P.0.产品(批号:10k1285)

    1. 2实验器材

    WDT2型脑立体定位仪:西安西北光电仪器厂生产;Morri。水迷宫设备全套(包括Morri。水迷宫,电脑摄像系统,配套软件分析系统):北京中科院生理所生产。

    2实验方法

    2. 1动物分组、造模与给药

    健康Wistar大鼠90只,其中3月龄15只,为青年对照组(以下称青年组)15月龄75只,随机抽取15只用作正常老年对照组(以下称老年组)。其余60只大鼠作为造模鼠。大鼠均由广西医科大学实验动物中心提供。

    动物适应性喂养1周后,造模用的60只大鼠腹腔注射0.96% D-gal,生理盐水(NS)配制,按5 mL/kg体重给药;青年组和老年组大鼠则腹腔注射等体积NS,每日1次,连续6周。从第7周开始进行脑内双侧nbM核注射IBA。方法:大鼠以3%戊巴比妥钠35 mkg体重腹腔麻醉,将大鼠固定于脑立体定位仪上,在前自后0. 8 mm,中线旁开2. 6 mm,颅骨下8. 2 mm,每侧缓慢注射IBA 1 u( NS配制,浓度g/L)[1]。青年组和老年组在相同脑区内注射等体积NS.2周后,将造模组存活的大鼠随机分为模型对照组(简称模型组),PNS高剂量组(简称高剂量组),PNS低剂量组(简称低剂量组)和石杉碱甲阳性对照组(简称石杉碱甲组)。高剂量组以PNS灌胃,200 mg/kg体重给药;低剂量组以PNS灌胃,100 mkg体重给药;石杉碱甲组以0. 3 mkgHup-A灌胃给药;模型组、青年组和老年组以等体积NS灌胃。各组均每日给药1次,连续4周,完成造模和治疗。

    2. 2大鼠学习与记忆行为测试

    采用MWM测试法,进行定位航行试验和空间探索试验。MWM参照有关文献制作[2]。迷宫置于房间的中央,为一圆形不锈钢水池,直径200 cm,高50 cm,水深30 cm。将水池等分为4个象限,在象限3中心放置一平台,平台为圆形,直径11 cm,平台高29 cm(即平台低于水面1 cm,称隐藏平台)。水迷宫正上方2m高处装有一个小型摄像机,并与另一房间的录像机和监视器连接,记录大鼠的游泳轨迹和游泳时间。

    (1)定位航行实验(place navigation ):共进行5d,每天分上下午2个时间段,每一时间段每鼠训练4次。将大鼠面向池壁由4个人水点放人池中,测其60 s内成功进驻平台(大鼠找到平台并滞留其上5s为成功进驻)所需时间(即逃避潜伏期,escapelatency )。如在60 s内大鼠不能成功进驻平台,则实验者将其引上平台并令其停留10s,记录逃避潜伏期为60s,每次训练间隔时间为60s

    (2)空间探索试验( spacial probe test) ; MWM实验最后1d,撤除平台,从原平台象限对侧池壁中点将大鼠放人水中,记录2 min内大鼠在原平台象限的游泳时间和游泳轨迹,计算大鼠跨跃平台次数及各象限游泳时间占总时间百分比。

    2. 3评价指标与统计方法

    定向航行实验统计量为逃避潜伏期、寻求次数。空间探索试验统计大鼠原平台象限游泳时间占总游泳时间百分比(简称原平台象限比)、跨越原平台次数。数据以Sl'SS 11. Sfor Window。统计软件分析,各组间差异采用重复测量多因素方差分析[3-4]及单因素方差分析,方差齐时用SNK法检验,方差不齐时用Game,一Howell检验。

    3结果

    3. 1定位航行试验

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    结果见图1

    由图1可见,模型组潜伏期Sd内变化平缓,无明显缩短,给药治疗的各组潜伏期随着训练天数的增加而明显缩短。说明模型组大鼠学习记忆行为能力明显受损,药物对痴呆模型均有一定程度的保护作用。以SNK法进一步对各组作两两比较,结果见表1.

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    由表1可见,模型组大鼠逃避潜伏期明显延长,与其他各组相比均具有显著性差异(P<0.05),各给药组与青年组、老年组比较均有显著性差异(P<0. 05 )。模型组与其他各组的寻求次数差异均具有显著性(P < 0. 05 )。低剂量组、石杉碱甲组、高剂量组、老年组、青年组寻求次数均值从小到大依次排列,且两两相邻间比较无显著差异(P>0.05),不相邻间各组两两比较均具有显著性差异(P<0.05)03. 2空间探索实验结果见表2.

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    由表2可见,组间两两比较(SNK)结果显示,跨平台次数除模型组外其他各组两两间均无显著性差异(P>0.05),而各组与模型组均有显著性差异(P < 0. 05 )。原平台象限比模型组较其他各组明显偏小,差异显著(P<0.05);给药各组间及与老年组间两两无显著差异(P>0.05),而与青年组则均有显著性差异(P < 0. 05)

    4讨论

    AD患者的临床表现为智力减退、近期记忆缺失,以及相关行为能力障碍,因此观察AD模型及药物治疗效果的重要指标之一,就是对学习记忆进行直接客观的评价。

    MWM实验是英国心理学家Morri。于20世纪80年代初设计并用于空间学习记忆的大脑机制研究领域[5]。就记忆属性的不同分类系统来看,经典MWM所检测的是大鼠在多次的训练中形成的一种空间参考记忆,其储存的机制主要涉及边缘系统及大脑皮层有关脑区,属于陈述性记忆[3]。临床健忘或痴呆的患者,正是陈述性记忆首先受损而且比较突出[6]。所以从检测的记忆属性来说,运用MWM系统进行防治此类疾病有效药物的筛选研究是较为恰当的。MWM试验作为记忆量化的良好方法,其提供的参数众多,定位航行试验历时Sd,实验数据结构庞大且复杂,为准确反映出各组数据间客观存在的内在联系,统计学处理采用胡镜清等[3]推荐的重复测量多因素方差模型进行分析处理。

    研究证实[7] , AD患者nbM胆碱能神经元大量退行变性,因此采用兴奋性毒素损毁nbM可获得理想的胆碱能缺陷AD模型。本实验采用d-gal加速动物衰老基础上合并应用兴奋性神经毒素IBA损毁大脑双侧nbM核的方法建立AD大鼠模型,在脑组织形态、生化、临床病理指标上更加贴近AD实际病理改变多因素的复杂过程[8]。实验结果显示,模型组大鼠的各指标均劣于其他各组,差异显著,模型的建立较为成功。

    定位航行试验的Sd训练中,PNS高剂量组大鼠对平台的寻求次数明显提高,较石杉碱甲组及低剂量组差异显著,接近正常老年组水平。在潜伏期的指标分析中,石杉碱甲组数值上略优于高、低剂量组,但3组统计学处理无显著性差异。空间探索试验各指标中,各给药组与老年组间两两比较无明显差别,而与模型组比较均有显著性差别,说明各药物的治疗均对模型鼠的学习记忆能力起到了改善作用,但结合前面的定位航行试验指标,还不能认为药物的保护作用使模型鼠的学习记忆能力恢复到了正常老年鼠水平。空间探索试验各给药组间及与老年组间两两比较无明显差异,这可能与大鼠的空间探索策略有关,老年组大鼠对平台空间位置有较好的记忆,当其数次跨越原平台位置而未找到平台时,开始怀疑其记忆,遂进行另外新的探索。对空间探索试验做探索策略相关指标分析应是有待改进的方法之一。

    通过对PNS影响AD模型大鼠空间学习记忆的研究发现,PNS对老年性痴呆模型大鼠学习记忆功能损害有明显的改善作用,为三七的临床新用途提供了参考。 

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